新型药物载体聚谷氨酸的合成及其应用
γ-聚谷氨酸（Polyglutamic acid，PGA）是由L-谷氧酸（L－Glu）、D-谷氨酸（D-Glu）通过肽键结合形成的一种多肽分子，在自然界或人体内能生物降解成内源性物质Glu，不易产生积蓄和毒副作用。它的分子链上具有活性较高的侧链羧基（－COOH），易于和一些药物结合生成稳定的复合物，是一类理想的体内可生物降解的医药用高分子材料。本文综述了PGA的制备方法及其作为药物载体和医用粘合剂的应用。
PGA的制备
目前PGA的生产技术主要有化学合成法、提取法、生物聚合法。
化学合成法
传统的肽合成法 传统的肽合成法是将氨基酸逐个连接形成多肽，这个过程一般包括基团保护、反应物活化、偶联和脱保护。化学合成法是肽类合成的重要方法，但合成路线长、副产物多、收率低，尤其是含20个氨基酸以上的纯多肽合成。
二聚体缩聚 由L－Glu，D－Glu及消旋体（DL－Glu）反应生成α-甲基谷氨酸，后者凝聚成谷氨酸二聚体后，再和浓缩剂1-（3-二甲氨丙基）3-乙基碳亚二胺盐酸盐及1-羟苯基三吡咯（1－hydroxy benzotriazole）水合物在N，N－二甲基甲酰胺中发生凝聚，获得产率为44％～91％、相对分子质量为 5000～20000的聚谷氨酸甲基酯，经碱性水解变成 γ－PGAo
化学合成法难度很大，没有工业应用价值。
取取法早期，日本生产PGA大多采用提取法，用乙醇将纳豆（一种日本的传统食品）中的PGA 分离提取出来。由于纳豆中所含的PGA浓度甚微，且有波动，因此，提取工艺十分复杂，生产成本甚高，同样难以大规模生产。
微生物的生物素合法 自从1942年Bovar nick等发现芽孢杆菌属微生物能在培养基中蓄积γ－ PGA以来，利用微生物生物聚合生成γ－PGA的研究十分活跃。
地衣杆菌发酵制备 地衣杆菌ATCC9945a 是能够生产γ－PGA的细菌族的一种。不同的碳源、氮源和pH值及是否通气等因素对地衣杆菌发酵生产γ－PGA有明显的影响。Ko等研究表明，对细胞生长而言，葡萄糖是较好的碳源；对产γ－PGA而言，培养基配方中使用葡萄糖和甘油的混合物并加入Glu则大大增加产率，尤其是以NH4C1作为氮源时，Glu的加入极为重要。Cromwick等研究了 pH值和通气性对地衣杆菌批量发酵生产γ－PGA的影响情况，发现pH为6.5时产量最高，柠檬酸的消耗量也增加，表明柠檬酸在转化生产γ－PGA中起了重要作用。通过对γ－PGA的立体结构和相对分子质量进行分析测定表明，pH值的改变使产量下降但对产物质量没有明显影响，增加通气量也引起产量的增加。Ho－Nam等配制了以适当比例的甘油， L－Glu，柠檬酸，NH4C1，K2HPO4，MgSO4·7H2O，Fe CI3·6H2，CaCl2·2H2O，MnSO4·H2O组成的培养基，在37℃t、pH6.5.通入纯氧和空气的混合气并保持氧压力在30％饱和度以上的条件下发酵培养 24h，可得到高产量的γ－PGA发酵液。
枯草芽孢杆菌发酵制备 枯草芽孢杆菌族中能生产γ－PGA的菌有多种，Ogawa等进行了枯草芽孢杆菌大规模的不发泡的稳定发酵生产，以麦芽糖、大豆浆、谷氨酸钠、K2HPO4、MgSO4·7H2O为培养基，添加3％的NAC1以有效阻止发泡，随着振荡速度和加入液体培养基中Glu量的增加，γ-PGA 的产量随之增加。在适宜的条件下，能得到大约 35mg·mL-1的γ－PGA。Hidetoshi等对枯草芽孢杆菌F2-01生产γ-PGA的发酵培养进行了研究，在 37℃培养4d，调节pH值，过滤，滤液加入到3倍体积的乙醇中，收集沉淀。再用去离子水溶解，自来水透析过夜，透析液过DEAE－T650柱去除杂质，NaC1 梯度洗脱，分别收集。含粘性物质的收集液再次透析过夜。收集物经冷冻干燥，分析测定，证明是γ- PGA，相对分子质量为105。通过不同氨基酸对 PGA生成的影响的研究，发现L－Glu起的作用最明显，D-Glu作用略弱，其他氨基酸没有明显的影响。当L-Glu浓度为7.0％时PGA对L－Glu的转化率为68％。而Kumioka等分别以葡萄糖、柠檬酸、乙酸、L-苹果酸、琥珀酸、富马酸等作为枯草芽孢杆菌IF-03335碳源，（NH4）2SO4为氮源，发酵生产γ- PGA，研究发现柠檬酸是该菌发酵生产γ－PGA的最佳碳源，L－Glu添加到培养基中能大大刺激γ－PGA 的生产（0.45mg·mL-1），且没有副产物。
微生物发酵生产的γ－PGA的分离提取 通过微生物发酵得到高粘度的发酵液，可用有机溶剂沉淀法、化学沉淀法和膜分离沉淀法获得γ－PGA。
有机溶剂沉淀和化学沉淀是指利用离心或凝聚菌体的方法除去发酵液中的菌体，在上清液中加入低浓度的低级醇类（如甲醇、乙醇），也可以是丙酮，体积为上清液的2～5倍，沉淀得到γ-PGA。然后用水溶解γ-PGA，透析除去小分子，滤液冷冻干燥得到白色结晶。也可用饱和CuSO4，NaC1溶液沉淀γ－ PGA。
对高粘度的发酵液还可采取膜分离沉淀法。
因为发酵液粘度很高，离心非常困难。若将发酵液 pH值调到2～4，粘度随pH值的下降而下降，当pH 值为3时发酵液粘度降为1／6，但在pH值＜2时，微生物会发生降解，pH值为7～8时，发酵液粘度也下降，pH＞8，粘度又会上升。调节pH值主要是使细胞表面电荷减少，菌体发生凝聚，使离心更有效。如 pH为3，在6000r·min-1时离心30min可有效地把菌体从含24～309·L-1的γ－PGA的发酵液中分离出来。γ-PGA是一种相对分子质量为1×10-6～2× 106的线型分子，可用分子截留量在5×104的超滤膜和蠕动泵使γ-PGA浓缩到100g·L-1，然后再用己醇处理浓缩液，这样乙醇的消耗量大为减少。如把4L浓度为25g·L-1的发酵液浓缩到IL浓度为 100g·L-1的发酵液，再用2.5L乙醇提取可得到60g γ－PGA，大大降低了γ-PGA分离提取的成本。
γ－PGA作为药物载体的应用
γ－PGA具有良好的生物亲和性和生物降解性，作为药物载体可提供药物缓释性、靶向性，提高药物水溶性，降低药物不良反应，从而提高药物疗效。
作为抗肿瘤药物的载体
作为金属螯合物抗癌药物顺铂（CDDP）的载体 CDDP（Cis－DichlordiammineplatinumⅡ），顺二氯二氨铂又叫顺铂，为重金属络合物，微溶于水，且在水中不稳定，疗效低，细胞毒性大。现采用 γ－PGA（相对分子质量为4×104）作为药物载体，使 PGA分子中侧链按基上的氢取代CDDP分子中的氯原子，形成有活性的、相对稳定的CDDP－PGA复合物，该复合物有较高的动力学稳定性和对正常细胞较低的毒性，有利于Pt2+对配体的亲和。1mol的 PGA可与60mol的CDDP键合形成CDDP-PGA复合物，复合物的细胞毒性较低，仅为游离的CDDP 的1／3。动物实验表明，CDDP－PGA能有效抑制卵巢癌的生长，而且其治疗剂量范围宽，如CDDP－ PGA的使用使80％受试动物存活的剂量（ED80）为 3～12mg·kg-1，而对照品CDDP的剂量范围为1～ 2·5mg·kg-1。
作为水不溶性的植物类化疗药物的载体
化疗药物大多难溶或不溶于水，细胞毒性大，选择性小。用PGA作为载体后，可提高这类药物的生理药理活性，增强动力学稳定性，提高疗效，降低细胞毒性，增强对肿瘤细胞的靶向性和选择性。如喜树碱（camptothecins，CPT）难溶于水，而且它的内酯形式不稳定，导致使用受限制，疗效低。但10-羟CPT或 9-氨基CPT与PGA偶联形成CPT-PGA复合物后，水溶性大为增加。复合物对同源的和异源的肿瘤都保持较高的抗肿瘤活性，且比游离的CDD活性强。制备此复合物的PGA相对分子质量为3.7×104～ 5.0×104，CPT载药量为14％～37％。
红豆杉中紫杉烷类化合物，大部分具有抗肿瘤活性，如紫杉醇（paclitaxel，TXL）类，但其水溶性差，药用开发受到很大限制。它们的PGA酯或盐的形式则显示了较高的水溶性、广谱的抗癌性和良好的药代动力学性质，在体内消除缓慢，作用时间延长，生物利用度提高，且细胞毒性低，对肿瘤靶向性强。HPLC分析揭示，在细胞外TXL－PGA复合物不断地释放TXL，随后输送到细胞内，维持TXL在细胞内的浓度，延长TXL在血浆中滞留时间，加强 TXL在肿瘤组织中的分布。
作为抗生素类抗癌药物的载体 PGA可用于多柔比星（阿霉素，ADR）的载体，在ADR和PGA 之间插入甘氨酸（GIy）形成PGA－GlyGlyGlyLeuADR 复合物，对小鼠进行腹腔给药（5mg·kg-1）实验，以 ADR作对照，结果表明，该复合物可使白血病小鼠存活时间明显延长，最长可达50d。
作为其他药物的载体 PGA的半乳糖或甘露糖酯化衍生物可作为肝细胞特殊药物的载体，通过糖酯化的PGA的结合作用把相对分子质量低的药物运送到肝细胞中。动物静脉内给药（1mg· L-1）实验表明，药物与糖酯化的PGA形成的复合物在肝脏中蓄积，起到了靶向作用。糖酯化的PGA 在肝脏中迅速酶解为内源性物质Glu，不会在体内产生积蓄和不良反应。
作为外用药物的载体 PGA与明胶有较好的兼容性，适合制作外科及手术用的粘胶剂、止血剂及密封剂。
可生物降解的速效生物胶 可生物降解的速效生物胶由明胶（Gelatin）和PGA结合而成。相对分子质量较低的明胶其水溶液在25℃时不会自发形成凝胶，但在较高温度下发生物理交联引起自发的胶凝，相对分子质量较大的明胶在室温下也有胶凝现象发生，添加尿素可有效防止这一物理现象。形成的明胶-γ－PGA生物胶经水溶性碳化亚二胺（water－soluble carbodiimide，WSC）诱导交联产生三联体速效生物胶，尿素的添加不影响这种交联。与传统的相对分子质量较大的明胶相比，当复合物浓度低于初始的明胶自发胶凝浓度时，复合物对小鼠皮肤的粘连强度随明胶和PGA浓度的增加而增加，与明胶分子大小无关。但在不引起自发胶凝作用的最大明胶浓度时，相对分子质量较低的明胶、速效生物胶的粘连强度比相对分子质量较高的明胶和传统的纤维蛋白胶的都要高。相对分子质量为1× 104的明胶和PGA的混合物用WSC交联后形成的生物胶和纤维蛋白胶一样能迅速胶凝，有着超越纤维蛋白胶的粘附性，这是一种生物安全胶，在小鼠背部皮下组织进行实验，发现其能逐渐生物降解，没有严重的炎症反应。
作为新型外科用胶的组成部分 虽然纤维蛋白胶已被广泛用作外科用粘附剂，但它的成分纤维胶原和凝血酶都是从人类血液中提取的，这就可能感染肝炎和艾滋病。由相对分子质量为2.2× 104或7.2×104N-羟琥珀酰胺（NHS）活化的PGA 衍生物，即使在低温下也不会失去与明胶的交联能力，而且这种稳定性可持续较长时间。NHS活化的PGA能自发地与明胶在水溶液中短时间内形成胶体。由相对分子质量为2.2×104的PGA制备的NHS活化形式在高浓度时能迅速分解，浓度降低。由PGA制备的这种外用胶与天然组织的粘连强度远比纤维蛋白胶高，这是一种非常好的外科粘附材料，可能取代从人类血液组织中制备的纤维蛋白胶。
另一种新型外科用胶是由PGA、猪胶原、WSC 组成的胶原胶，组织测试以50mg·L-1胶原胶处理，发现胶原胶渗入细胞内部的速度比纤维蛋白胶快。制备所用材料不含血液中成分，不涉及血液供应，因此是一种安全价廉的外科用粘附材料。
用PGA制备的生物胶用途广泛，如用于气漏和止血等。气漏是发生在肺、胸腔手术中的一个常见性问题，三联体生物胶对气漏的封堵比传统的纤维蛋白胶好。经速效生物胶处理的肺气漏在 50cmH2O肺压时大约有80％表现出完好状态。 PGA制备的生物胶对针刺伤的狗脾脏出血的止血作用比传统纤维蛋白胶强，脾脏出血量明显减少，用胶频率减少，完全止血的成功率增加。
结语
微生物发酵法制备PGA较化学合成法和提取法具有反应条件温和、工艺简单、环境良好、可大规模生产等优点；但菌株生成PGA的代谢途径复杂，调节方式多样，发酵液中PGA的生成浓度低，产物的分离纯化困难。对此结合发酵工艺和酶工程，可利用酶转化法采用一步酶促反应，来避免全合成途径中复杂的反馈调节作用，使PGA高浓度积累。而谷氨酰转肽酶又是一种广泛存在于菌体中的酶，利用酶的高效性和专一性，可得到高浓度的产物，从而有利于产物的分离纯化。
PGA具备良好的生物安全性、生物可降解性和较强的亲和性，已成为理想的药物载体或介质，具有广阔的应用前景和经济价值。
